PEMERIKSAAN VIABILITAS SEL METODE KOLORIMETRI MTS ASSAY

PEMERIKSAAN VIABILITAS SEL METODE KOLORIMETRI

MTS ASSAY

Agak sulit untuk menilai kondisi sel masih hidup atau sudah mati jika hanya berpatokan pengamatan morfologi, memang pada umumnya sel mati memiliki bentuk tidak beraturan lagi akibat tidak adanya mekanisme yang mempertahankan keutuhan membran selnya. Akan tetapi tidak selalu juga sel yang masih nampak baik menandakan sel tersebut dalam keadaan hidup. Sel-sel yang masih hidup merupakan sel ditandai dengan viabilitas.

Dalam Kultul sel, pemeriksaan viabilitas merupakan salah satu yang fundamental. Pemeriksaan ini dapat dilakukan secara langsung maupun tidak langsung. Pemeriksaan langsung dilakukan dengan cara pewarnaan, sel-sel yang mati akan menerap zat warna sedangkan sel yang hidup tidak akan terwarnai. Hal ini berhubungan dengan kemampuan sel mempertahankan keutuhan membran sel. Sel yang hidup secara selektif dan aktif mengatur transport keluar masuk membran sel, sedangkan sel yang telah mati kehilangan kemampuan ini.

Cara kedua dilakukan dengan pengukuran secara tidak langsung, yaitu dengan mengukur aktivitas metabolisme sel, produk-produk hasil metabolisme seperti LDH, NADH dan NADPH dapat menjadi marker aktivitas sel yang masih hidup. Beragam metode pengukuran secara tidak langsung telah banyak dikembangkan yang paling umum dikerjakan adalah metode MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide. Metode sejenis lainnya adalah XTT (sodium3c’-[1-(phenylaminocarbonyl)-3,4-tetrazolium)-bis-(4-methoxy-6-nitro)benzene sulphonic acid hydrate).

Metode MTT sekarang ini mengalami pengembangan menjadi metode MTS. Hasil pengukuran MTS Assay dapat digunakan untuk menghitung LC₅₀ (lethal consentration) pada uji daya sitotoksik dan IC₅₀ (Inhibition concentration) daya antiproliferasi. 

Metode MTS assay didasarkan pada reaksi redoks enzimatik yang menghasilkan perubahan warna (kolorimetri). Pereaksi MTS (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium) akan mengalami reduksi oleh NADH dan NADPH yang merupakan produk dehidrogenasi sel yang hidup. Reaksi reduksi diperantarai electron coupling agent PMS (Phenazine Methosulfate). Produk akhir reaksi berupa formazan berwarna ungu yang intensitas warnanya dapat diukur secara kolorimetri. Intensitas warna yang terbentuk setara dengan viabilitas sel. Reaksi ini terjadi terjadi secara intraseluler (ProMega, 2012).

Reaksi Reduksi MTS (Pro Mega, 2012)

Reagen MTS dan PMS harus disimpan pada suhu -20^oC dan terlindung dari cahaya. Saat hendak dipakai kedua reagren dibiarkan mencair pada suhu kamar dan terlindung dari cahaya. Setelah 90 menit, MTS dan PMS dicampurkan dengan perbandingan (MTS:PMS) 20:1. Campuran tersebut disebut sebagai pereaksi MTS. Pereaksi MTS dihomogenkan dengan bantuan vortex. Pereaksi dilindungi dari paparan cahaya langsung. Setelah siap, ke dalam masing-masing well pengujian ditambahkan 20 μL pereaksi MTS, kemudian dihomogenkan dengan mengetuk-ngetuk well dengan jari secara perlahan. Setelah itu well plate diinkubasi dalam inkubator CO₂ 5% bersuhu 37^oC selama 2 jam. Selama inkubasi well plate tidak boleh terkena paparan cahaya.  Setelah inkubasi 2 jam, intensitas warna hasil reaksi dibaca menggunakan ELISA Reader pada λ = 490 nm dan ditentukan viabilitas sel hasil pengujian dengan rumus berikut :

% Viabilitas  =  {[Abs S - Abs K] / [Abs K - Abs M]} x 100% 

Keterangan

% Viabilitas       : Persentase sel MCF-7 yang hidup

Abs S                : Absorbansi reaksi pada perlakuan

Abs B                : Absorbansi reaksi pada blanko ekstrak pada konsentrasi n

Abs K                : Absorbansi reaksi pada kontrol

Abs M              : Absorbansi reaksi pada blanko media

Interferensi dalam pemeriksaan

Faktor	Interferensi	Penanggulangan
Kadar Glukosa Media kurang	Rendahnya kadar glukosa menyebabka menurunnya laju glikolisis, sehingga hasil pengukuran rendah palsu.	Jangan gunakan media dari sisa kultur tissue flash, gunakan stok media baru.
Presipitasi Protein	Beberapa jenis pelarut organic ataupun perubahan pH dapat menyebakan presipitasi protein serum, yang akan mengganggu pembacaan karena menimbulkan kekeruhan.	Gunakan pelarut lain, dan atur pH media
Phenol red	Warna Phenol red berubah seiring perubahan pH, dapat menpengaruhi pembacaan hasil reaksi	Atur kembali pH medium atau gunakan media tanpa phenol red.
Confluency	Pastikan konfulensi sel kultur merata, kultur sel yang tidak konfluen ataupun terlalu rapat dapat mempengaruhi pengukuran laju metabolisme karena efek senescent antar sel.	Tetapkan batas minimal sel yang dipakai dalam setiap well plate. Umumnya antara 10.000 – 20.000 per wel plate, atau tergantung jenis dan jumlah sel yang ada.
Laju metabolisme	Laju metabolisme sel dapat berubah-ubah seiring dengan umur kultur, banyaknya re-culture, dan perlakuan yang dilakukan	Setiap kali pengerjaan sertakan pengukuran kontrol dan blanko, gunakan kurva standar dalam setiap pengerjaan

Referensi :

ProMega. 2012. Cell Titer 96 Aqueus Solution One Solution Cell Proliferation Assay. Madison USA: Promega Corporation

Kupcsik, L. 2011. Estimation of Cell Number Based on Metabolic Activity: The MTT Reduction Assay, In Mamalian Cell Viability: Method and Protocol 3 Page 13-19. Humana Press Springer Science+Business Media (www.springer.com).

Stonddart, MJ. 2011. Cell Viability Assay : Introduction, in Mamalian Cell Viability: Method and Protocol Chapter 1 Page 1-7. Humana Press Springer Science+Business Media (www.springer.com).