BILIK HITUNG : Alat Bantu Hitung Sel yang Tidak Dapat Dilupakan

Alat Bantu Hitung Sel yang Tidak Dapat Dilupakan

Tedious pada tahun 1950-an dengan bantuan seorang engineering Wallace H. Coulter merupakan penemu pertama alat penghitung sel secara otomatis berbasis prinsip Couler Counter. Couler Counter adalah sebuah apparatus yang digunakan untuk menghitung dan mengetahui ukuran partikel yang tersuspensi dalam larutan elektrolit. Ukuran dan jumlah partikel diketahui dengan cara elektrik impedance (perubahan signal elektrik). Dalam 20 tahun terakhir perkembangan hematologi analyzer menunjukan tren yang meningkat baik dari sisi pengguna maupun pengembangan metode. Hampir semua laboratorium telah menggunakan hematologi analyzer karena keandalan analitiknya telah membantu efisiensi kerja laboratorium.

Walaupun hematologi analyzer sangat membantu pekerjaan teknisi laboratorium, pengerjaan hitung sel secara manual tidak serta merta boleh dilupakan. Hal ini karena hematologi analyzer masih memiliki beberapa keterbatasan seperti :

1.      Linieritas

Dalam setiap manual book hematologi analyzer selalu dicantumkan hal-hal yang perlu diperhatikan user sebagai bahan verifikasi hasil. Ada kalanya konsentrasi sel yang terlalu tinggi menyebabkan alat tidak mampu menghitung jumlah sel secara akuran, ataupun konsentrasi sel yang terlalu encer menyebabkan alat memebrikan alarm kepada user untuk melakukan cross check.

2.      Keterbatasan Differensiasi Sel

Sampai dengan hari ini, hematologi analyzer hanya mensortir sel berdasarkan ukurannya terumata ketika menghitung jumlah eritrosit dan trombosit. Belum reagen khusus yang dapat mensortir eritrosit dan trombosit. Pada seri leukosit juga, walaupun telah ada reagen khusus yang dapat melisiskan sel selain leukosit, namun diferensiasi seri-seri leukosit masih terbatas hanya pada pewarnaan kromatin pada inti leukosit. Seringkali dijumpai ketika banyak seri-seri sel muda (seri sel sebelum matang menjadi seri batang), hematologi analyzer tidak dapat membedakan seri sel-sel muda tersebut.

3.      Faktor Pra-Analitik

Berhubungan dengan kualitas sampel, seperti pengaruh teknik sampling, lama penundaan pemeriksaan, serta pengaruh koagulan juga dapat menimbulkan keterbatasan akurasi hematologi analyzer.

Guna mengatasi keterbatasan tersebut setiap manual book hematologi analyzer selalu mencantumkan alur problem solving terhadap setiap alarm yang muncul. Salah satu tahapnya tentu saja konfirmasi manual secara mikroskopis. Semisal jumlah eritrosit yang lebih dari 6 juta sel per mm³ atau jumlah leukosit lebih dari 20.000 sel per mm³ menimbulkan alarm. Langkah pertama selalu diminta periksa ulang sampel (delta check) jika setelah dicek kualitas sampel masih baik dan volumenya cukup. Dapat juga diminta dilakukan pengerceran sampel, ataupun konfirmasi hitung manual sebelum memastikan dilakukan sampling ulang (perlu dihindari).

Ukuran sel yang mikroskopis menyuulitkan untuk dihitung maka untuk menghitungnya kita memerlukan bilik hitung. Bilik hitung seperti layaknya sebuah ruangan yang diketahui ukurannya, sejumlah volume sampel dihitung jumlah selnya, kemudian hasil yang didapat digunakan untuk menaksir jumlah sel yang terkandung dalam volume darah tertentu.

10 uL sampel diencerkan 20x, kemudian hasil pengenceran dihitung jumlah selnya menggunakan bilik hitung yang berukuran 3 x 3 x 0,1 mm (p x l x t). Volume bilik hitung= 0,9 mm³

Area hitung 0,9 mm³ ditemukan sebanyak 45 sel. Maka berapa jumlah sel per mm³

Gunakan logikan perbandingan matematika !

0,9 mm³ = 45 sel …………Telah diencerkan (P = 20)

1 mm³ = sel ?

Jumlah Sel per mm³  = (45 x 1 x 20) : 0,9

Jumlah Sel per mm³  = 1000 sel/mm³  

Rumus Dasar Perhitungan

Jumlah Sel =	Sel Terhitung x FP	FP = Faktor Pengenceran ex : 10 uL  sampel diencerkan sampai dengan 1000 uL. Artinya 10 uL sampel ditambahkan pengencer sebanyak 990 uL. Maka FP = V akhir / V awal = 1000/10 = 100 x
	Area Hitung x t
		P =	1	Area hitung = luas bilik hitung yang dipakai t = tinggi = 0,1 mm
			FP
Jumlah Sel =	Sel Terhitung	P = Pengenceran = Konsentrasi Hasil Pengenceran ex :  Lakukan pengenceran 1 : 100, maka 10 uL  sampel diencerkan sampai dengan 1000uL. Artinya 10 uL sampel ditambahkan pengencer sebanyak 990 uL. Maka P = V awal / V akhir = 10/1000 =  0.01 atau 1/100 = 0.01
	Area hitung x t xP

Ada beberapa jenis bilik hitung yang digunakan di laboratorium yang tergantung penggunaannya. Diantarnya sebagai berikut :

1.       Improve Neubauer

Bilik hitung Improve Neubauer merupakan bilik hitung yang paling banyak digunakan untuk menghitung sel leukosit, eritrosit, trombosit,termasuk  sel bakteri, kultur sel, spora, maupun sel yeast secara manual.

Improve Neubauer memiliki area hitung berukuran 3 x 3 x 0,1 mm. Area hitung tersebut ditandai dengan garis-garis yang jika diraba teras timbul di atas permukaan. Area ini disebut bilik hitung (Perhatikan gambar di atas). Jika dilihat pada mikroskop maka bilik hitung tersebut nampak seperti gambar di bawah ini:  

Improve Neubauer

Biliki hitung dibagi menjadi 9 kotak yang luasnya sama (dipisahkan oleh 1 garis tebal), masing-masing berukuran 1 x 1 mm 3 mm dibagi 3 bagian). Area yang ditandai simbol “L” merupakan area hitung sel yang jumlahnya diperkirakan kurang dari 1 juta sel/mm³ atau yang secara ukuran relatif besar (pada pembesaran lensa objektif 10x nampak jelas).  Sel darah yang dapat dihitung di area L contohnya adalah leukosit.

Jumlah Leukosit / mm3 =	a x FP	a  : Leukosit di Bilik Hitung
	Area Hitung x t	FP : Faktor Pengenceran
=	a x FP	Dihitung pada 4 kotak L
	1 x 1 x 0,1 x 4
=	a x FP
	0,4
=	a x FP x 2,5

Sedangkan untuk menghitung jumlah sel yang diperkirakan jutaan per mm³-nya atau yang memerlukan pembesaran lensa objektif 40x, perhitungan umumnya menggunakan bagian tengah bilik hitung.

Bagian tengah bilik hitung berukuran 1 x 1 mm. area ini kemudian dibagi menjadi 25 area kecil berukuran 0,2 x 0,2 mm (1 mm dibagi 5 ) yang dipisahkan oleh 3 rangkap garis. Area yang yang ditandai simbol “E” adalah area hitung, dapat juga diagonal kiri atau kanan, atau pun 5 kotak yang terdiri dari pojok atas kanan atas dan kiri, tengah, pojok bawah kanan dan kiri.

Jumlah Eritrosit/mm3 =	a x FP	a  : Eritrosit di Bilik Hitung
	Area Hitung x t	FP : Faktor Pengenceran
=	a x FP	Dihitung pada 5 kotak E
	0,2 x 0,2 x 0,1 x 5
=	a x FP
	0,02
=	a x FP x 50

Note : Rumus jumlah trombosit sama dengan rumus jumlah eritrosit

Improve Neubauer Bright-Line

Sifat sel yang bersifat transparan kadang menyulitkan dalam pengamatan yang berdampak pada akurasi perhitungan. Untuk mengatasi keterbatasan tersebut biasanya digunakan pewarnaan pada sel, namun jika kualitas reagen kurang baik serta perlakuan tidak sebagaimana mestinya dapat berdampak pada lisisnya sel.Oleh karena itu ada modifikasi dalam bilik hitung. Garis-garis pada bilik hitung dilapisi dengan rhodium, pada mikroskop cahaya garis ini akan tampak lebih terang atau  ümenjadi lebih gelas ketika kontrans mikroskop diubah. Bilik hitung ini disebut Improve Neubauer Bright-Line.

2.       Neubauer

Bilik hitung Neubauer merupakan model lama dari Improve Neubauer. Neubauer berukuran 3 x 3 x 0,1 mm. Bilik hitung dibagi menjadi 9 area kotak besar, yang masing-masing berukuran 1 x 1 mm. Area yang diberi simbol “L” digunakan untuk menghitung leukosit. Perhitungan sama seperti pada Improve Neubauer.

Perbedaan mendasar antara Improve Neubauer dan Neubauer terlihat pada pembagian area di tengah bilik hitung (Perhatikan gambar di bawah ini).

Pada Neubauer area tengah sebesar 1 x 1 mm dibagi menjadi 16 kotak kecil yang dipisahkan 3 garis rangkap. Masing-masing kotak berukuran 0,25 x 0,25 mm (1 mm dibagi 4). Area yang diberi simbol “E” adalah area hitung, dapat juga 4 kotak diagonal kiri atau kanan ditambah 1 kotak dari area pojok. Lima kotak pun bisa berasal dari 4 kotak dari sisi pojok kanan-kiri atas dan bawah dan 1 kotak dari area tengah.

Jumlah Eritrosit/ mm3 =	a x FP	a  : Eritrosit di Bilik Hitung
	Area Hitung x t	FP : Faktor Pengenceran
=	a x FP	Dihitung pada 5 kotak E
	0,25 x 0,25 x 0,1 x 5
=	a x FP
	0,03125
=	a x FP x 32

Note : Rumus jumlah trombosit sama dengan rumus jumlah eritrosit

3.       Thoma

Bilik hitung Thoma hanya digunakan untuk menghitung eritrosit dan trombosit saja. Perhatikan pembagian area bilik hitung Thoma pada gambar di bawah ini.

Area yang digunakan untuk menghitung sel adalah bagian tengah. Rumus Perhitungan eritrosit dan trombosit sama seperti pada Neubauer.

4.       Bürker

Bilik hitung Bürker mirip dengan bilik hitung Neubauer, berukuran 3 x 3 x 0,1 mm³. Hanya saja pada bagian tengah bilik hitung Bürker tidak dibagi menjadi area yang lebih kecil.

Bilik hitung Bürker dapat digunakan untuk menghitung leukosit, eritrosit dan trombosit. Leukosit dihitung pada Area pojok kanan atas, pojok kiri atas, pojok kanan bawah, pojok kiri bawah, dan tengah (Perhatikan gambar atas sebelah kiri) digunakan untuk menghitung leukosit. Sedangkan untuk eritrosit dan trombosit hanya menggunakan bagian tengah menggunakan minimal menggunakan 5 kotak kecil.

Jumlah leukosit/mm3 =	a x FP	a  : Leukosit di Bilik Hitung
	Area Hitung x t	FP : Faktor Pengenceran
=	a x FP	Dihitung pada 5 kotak L
	1 x 1 x 0,1 x 5
=	a x FP
	0,5
=	a x FP x 2
Jumlah Eritrosit/mm3 =	a x FP	a  : Eritrosit di Bilik Hitung
	Area Hitung x t	FP : Faktor Pengenceran
=	a x FP	Dihitung pada 5 kotak E
	0,25 x 0,25 x 0,1 x 5
=	a x FP
	0,03125
=	a x FP x 32

5.       Bürker Türk

Bilik hitung Bürker-Türk merupakan kombinasi dari bilik hitung Thoma dan Bürker. Dapt digunakan untuk menghitung leukosit, eritrosit, dan trombosit.

Leukosit dihitung pada 4 kotak besar (Pojok Kanan, pojok kiri atas, pojok kananbawah, dan pojok kiri bawah). Sedangkan untuk eritrosit dan trombosit, dihitung pada bagian tengah. Perhitungan leukosit lihat rumus Improve Neubauer, untuk rumus perhitungan eritrosit dan trombosit sama dengan bilik hitung Thoma

6.       Fuchs Rosenthal

Bilik hitung Fuchs Rosenthal umumnya hanya digunakan untuk menghitung sel pada cairan serebro spinal (LCS). Perhatikan pembagian area pada bilik hitung Fuchs Rosenthal pada gambar di bawah ini.

Bilik hitung Fuchs Rosenthal memiliki ukuran 4 x 4 x 0,2 mm. Bilik hitung dibagi menjadi 16 kotak besar (gambar kiri atas) yang masing-masing berukuran 1 x 1 mm (4 mm dibagi 4). Setiap satu kotak besar dibagi kembali menjadi 16 kotak kecil (gambar kanan atas) yang masing-masing berukuran 0,25 x 0,25 mm ( 1 mm dibagi 4). Leukosit dihitung pada 5 kotak

Jumlah Leukosit/ mm3 =	a x FP	a  :  Leukosit di Bilik Hitung
	Area Hitung x t	FP : Faktor Pengenceran
=	a x FP	Dihitung pada 5 kotak L
	1 x 1 x 0,2 x 5
=	a x FP
	1
=	a x FP

7.       Malassez

Bilik hitung Malassez umumnya dipakai untuk menghitung sel pada LCS dan nematode. Ukutan bilik hitung Malassez 2,5 x 2,0 x 0,2 mm.     

       

 

Bilik hitung Malassez dibagi menjadi 100 kotak (Gambar kiri atas) yang berukuran 0,25 x 0,2 x 0,2 mm. Perhitungan sel dilakukan pada area dimana kotak dibagi menjadi 20 kotak kecil (Gambar kanan atas).

Jumlah per mm3 =	a x FP	a  : Jumlah di Bilik Hitung
	Area Hitung x t	FP : Faktor Pengenceran
=	a x FP	Dihitung pada 5 kotak
	0,25 x 0,2 x 0,2 x 5
=	a x FP
	0,20
=	a x FP x 20

8.       Nageotte

Bilik hitung Nageotte memiliki ukuran 10 x 10 mm dengan ketinggian 0,5 mm. Bilik hitung ini umumnya digunakan untuk menghitung nematode atau sel pada LCS. Perhatikan gambar di bawah ini

Bilik hitung ini hanya dibagi dengan 40 garis horizontal membentuk 40 area persegi panjang berukuran 10 x 0.25 mm².

Kelengkapan lain yang harus ada pada saat menghitung sel dengan bilik hitung yaitu cover glass. Untuk bilik hitung Improve Neubauer, Neubauer, Thoma, Bürker-Türk, Bürker, dan Malassez cukup menggunakan cover glas berukuran 20 x 26 x 0,4 mm. Fuchs Rosenthal gunakan cover glass berukuran 24 x 24 x 0,4 mm. Nageotte, gunakan cover glass berukuran 22 x 30 x 0,4 mm.

Semoga Bermanfaat

Muh. Reza Jaelani

Referensi : www.brand.de